PEG-N3與炔基的生物正交和點擊化學

 

生物正交化學簡介

生物正交化學是指在不影響生物分子或干擾生化過程的情況下，在生物環(huán)境中發(fā)生的一系列反應。為達到此目的，反應必須滿足快速、高效和特異性的要求。
? pH值：反應必須在生理環(huán)境的溫度和pH值下發(fā)生；
? 精準：反應必須具有選擇性并且高效得到目標產品，且須不受水或內源性親核試劑、親電試劑、還原劑或復雜生物環(huán)境中氧化劑的影響；
? 快速：即便在低濃度下，反應也必須是快速的，并且須生成穩(wěn)定的反應產物；
? 特異性：反應應涉及生物系統中非天然存在的官能團。
生物正交反應的優(yōu)點和缺點

 

生物正交反應	優(yōu)點	缺點
Staudinger     連接反應	疊氮化物和膦化物具有生物相容性，生成的產物是以穩(wěn)定的酰胺鍵連接的。	反應速度慢，磷化氫容易被氧化。
CuAAC（疊氮+炔基）	反應迅速，在20 μM Cu(I)的催化下k值可達~10-100(M-1S-1)；具有良好的區(qū)域選擇性。	盡管有些配體如THPTA比較穩(wěn)定，但是銅催化劑的銅毒性仍需考慮在內。
SPAAC（疊氮+DBCO）	無需銅催化，k值約~1-60 (M-1S-1)。	1. 反應慢于CuAAC，大塊的環(huán)狀砌塊難以融入生物分子；     2. 所需溶劑：10%-40%的乙醇溶液或DMSO（至多60%）/PBS緩沖液；     3. pH < 5.5時反應速度會變慢，因為在此pH下DBCO的穩(wěn)定性會降低；     4. 巰基、疊氮化鈉都會與DBCO發(fā)生反應。
IEDDA (TCO + Tz)	反應非常迅速，k值約~1-106 (M-1S-1)	TCO在含水環(huán)境中穩(wěn)定性差。

 

? CuAAC：銅催化的疊氮-炔基環(huán)加

? SPAAC：疊氮-烷烴環(huán)化加成反應

 ? IEDDA：逆電子需求的D-A反應。

 

 

表1：各類生物正交反應的優(yōu)缺點小結表

疊氮-炔基點擊化學簡介

經典的點擊化學反應會用到銅作為催化劑，一般是一價銅催化1,3-偶極環(huán)加成炔和疊氮化物形成1,2,3-三唑[1,2]。一價銅的來源包括碘化銅、溴化銅、
銅屑或硫酸銅與還原劑發(fā)生反應生成的產物[3]。然而，一價銅具有熱力學不穩(wěn)定性，容易被氧化成無活性的二價銅，通常需要銅催化劑與合適的螯合配體共同制備。

優(yōu)化后的點擊化學反應是使用了用抗壞血酸鈉和一價銅穩(wěn)定的配體三（芐基三唑基甲基）胺（TBTA）還原硫酸銅來原位制備一價銅Cu(I)。通過這個方法，可以避免溶解氧氧化催化一價銅，因此能夠使得點擊化學反應更為有效。在典型的點擊化學中，硫酸銅是與TBTA預絡合的，現將這種復合催化劑與炔和疊氮化物混合，隨后再加入抗壞血酸鈉來引發(fā)點擊反應。
 

TBTA覆蓋了在點擊化學領域的大量實際應用，除了含水環(huán)境下的共軛反應。而水溶性的THPTA點擊配體則可以適用于水相反應，進一步簡化點擊化學步驟，為點擊化學反應提供具生物相容性的THPTA配體來結合Cu(I)，阻斷Cu(I)的生物利用度，改善其潛在的毒性作用，保持催化效率

[4]。同時THPTA配體可以有效地被用于高效標記活細胞，并維持細胞活性[5]。
 

我們發(fā)現THPTA在水相反應中是一種高效的點擊化學配體，它的標記反應在室溫下往往只需要15-30分鐘即可完成。在冷凍條件下儲存，配體CuSO4

復合物在至少一個月后仍能保持原有的活性。

實操案例

寡核苷酸類和DNA的標記

1. 配制以下原液：

? 200 mM THPTA配體的水溶液

? 100 mM硫酸銅水溶液

? 炔基標記的水相寡聚物

? 100 mM抗壞血酸鈉水溶液

? 10 mM在DMSO/叔丁醇或水中的含疊氮化合物

2. 在反應前將硫酸銅和THPTA配體以1:2的當量比混合靜置幾分鐘，這樣的溶液在冷凍后可以穩(wěn)定儲存數周；

3. 向寡聚糖/DNA溶液中添加過量4~50倍當量的疊氮化物（如PEG-N3等）；

4. 添加25當量的THPTA/CuSO4；

 

5. 添加40當量的抗壞血酸鈉；
6. 在室溫下靜置反應30~60分鐘；
7. 在乙醇中沉淀純化寡聚物。

 

 

細胞裂解物的標記

1. 配制以下原液：

? 100 mM THPTA配體的水溶液或緩沖溶液

? 20 mM硫酸銅水溶液

? 300 mM抗壞血酸鈉水溶液

? 2.5 mM在水或DMSO中的炔基或疊氮標記試劑

2. 對每個疊氮化物或炔基修飾的蛋白質裂解物樣品，添加以下物質至1.5 mL的離心管中，然后簡單渦旋混合：

? 50 μL存放于蛋白質萃取緩沖液中的蛋白質裂解產物（1-5 mg/mL）

? 90 μL PBS緩沖液

? 20 μL在水中或DMSO中2.5 mM相應疊氮化物（或含炔基化合物）的檢測試劑

3. 加入10 μL的100 mM THPTA溶液并簡單渦旋混合；

4. 加入10 μL的20 mM硫酸銅溶液并簡單渦旋混合；

5. 加入10 μL的300 mM 抗壞血酸鈉溶液來引發(fā)點擊化學反應并簡單渦旋混合； 

6. 保護反應避光，并在室溫下反應30分鐘；

7. 現在在裂解物中的蛋白質已通過點擊化學反應被標記了，可以進行下一步的處理和分析了。

 

銅催化的炔基-疊氮化物點擊化學標記活細胞

圖1：（上圖）細胞標記的步驟

（下圖）炔基探針試劑和催化劑添加劑

疊氮聚糖在HeLa和CHO細胞表面的標記及共聚焦顯微鏡成像

 

將細胞以1 × 105個/mL的濃度置于35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中培育，并在含有或不含50 μM Ac4ManNAz的生長培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青鏈霉素溶液的MEM培養(yǎng)基）中在37 ℃和5% CO2的條件下過夜反應。輕輕地抽吸培養(yǎng)基將多余的溶液移除，用1 mL DPBS洗滌細胞2次。在微量離心管中，4 ℃下以1:5的摩爾當量比將硫酸銅和THPTA添加到含有染料-1炔基或2炔基（濃度：25 μM）的DPBS和氨基胍（濃度：1 mM）中。配制新鮮制備的抗壞血酸鈉原液（100 mM）便于后續(xù)配制最終濃度為2.5 mM的抗壞血酸鈉溶液。將該反應混合物在4 ℃條件下冰浴保溫10分鐘，然后添加到細胞中。將此混合物再次在4 ℃保溫5分鐘之后，洗滌細胞，室溫下用3%多聚甲醛、0.3%戊二醛和1 mM的氯化鎂混合溶液在DBPS中固定10分鐘。加入4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對細胞核進行染色，并在每一步之間，用DPBS沖洗玻片3次，玻片采用Vecta Shield介質來安裝；使用Bio-Rad 2100共聚焦顯微鏡和60×的油鏡來進行切片成像，用ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/)來分析和處理得到的數據及圖片。對于雙標記的實驗，在標記反應后，用1 mL的生長培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后重新置于含有50 μM的Ac4ManNAz的培養(yǎng)基放置繼續(xù)培育20 小時。細胞表面標記的最佳條件為在4 ℃的培養(yǎng)基中，用25 μM的炔基化合物溶液、硫酸銅溶液（50 μM）、THPTA （250 μM）、氨基胍（1 mM）和抗壞血酸鈉（2.5 mM）標記1-5分鐘。
 

參考文獻

 

1. Polytriazoles as Copper(I)-Stabilizing Ligands in Catalysis; T. R. Chan, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. V. Fokin, Org. Lett. 2004, 6, 2858. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ol0493094
2. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation; V. Hong, S. I. Presolski, C. Ma, M. G. Finn, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 9879. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ange.200905087
3. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s; F. Manzenrieder, R. Luxenhofer, M. Retzlaff, R. Jordan, M. G. Finn, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 2601. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ange.201006134
4. Synthesis of Cyclic Peptide Disulfide–PHPMA Conjugates via Sequential Active Ester Aminolysis and CuAAC Coupling; K. A. Günay, H. Klok, Polym. Chem. 2016, 7, 970. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/py/c5py01817j
5. Cellular Consequences of Copper Complexes used to Catalyze Bioorthogonal Click Reactions; D. C. Kennedy, C. S. McKay, M. C. B. Legault, D. C. Danielson, J. A. Blake, A. F. Pegoraro, A. Stolow, Z. Mester, J. P. Pezacki, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 17993. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ja2083027

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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聚乙二醇（PEG） 生物正交化學 疊氮炔烴點擊化學 材料科學 生物醫(yī)學材料

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